Basi fisiologiche dei segnali biologici complessi

4 Attivazione cerebrale e segnali prodotti dalle richieste metaboliche

Nei precedenti capitoli si sono introdotte le basi fisiologiche dei segnali biologici elettromagnetici e le tecniche (EEG e MEG) che permettono di misurare le variazioni di attività elettromagnetica cerebrale. Adesso verranno prese in considerazione le variazioni metaboliche prodotte dall'attività cerebrale ed i metodi per evidenziarle. I cambiamenti dell'attività cellulare del cervello sono associati a cambiamenti delle richieste energetiche. Quanto maggiore è l'attività funzionale di un tessuto cerebrale, tanto maggiore sarà il suo metabolismo e, conseguentemente, le richieste energetiche (prevalentemente sotto forma di ossigeno e glucosio) aumenteranno. I neuroni, più delle altre cellule del corpo umano, hanno bisogno di un continuo apporto energetico fornito attraverso il sangue, e le aree attivate del cervello mostrano aumenti localizzati del flusso flusso ematico con conseguente maggior apporto di ossigeno e glucosio. Si sono sviluppate diverse tecniche di misurazione del flusso sanguigno e del metabolismo cerebrale.

Come spesso accade, l'avanzamento nelle conoscenze scientifiche va di pari passo con i progressi tecnologici, e la neurobiologia, in particolare, ne è un esempio eclatante. Difatti, negli ultimi 20 anni, si è assistito allo sviluppo di tecniche molto sofisticate che, sfruttando le variazioni emodinamiche prodotte dall'attività neuronale, sono in grado di identificare le aree attivate del cervello umano. Queste tecniche sono la risonanza magnetica funzionale (o fMRI) e la tomografia ad emissione di positroni (PET). Verranno ora descritte queste tecniche, cercando di comprendere le basi biologiche dei segnali di fMRI e PET.

4.1 La risonanza magnetica funzionale (fMRI)
Il corpo umano è composto prevalentemente da acqua e grassi. Il grasso e l'acqua sono a loro volta composti da molti atomi di idrogeno, che rendono il corpo umano composto per il 63% da atomi di idrogeno. L'atomo di idrogeno è costituito da un nucleo, un protone, circondato da un elettrone che gli orbita intorno. Il fenomeno di risonanza magnetica nucleare (RMN) o nuclear magnetic resonance (NMR) si basa sul comportamento del protone immerso in un campo magnetico. Il fenomeno che si basa sul comportamento di un elettrone all'interno di un campo magnetico si chiama risonanza degli spin dell'elettrone (RSE) o electron spin resonance (ESR). Il fenomeno che viene sfruttato per ottenere immagini anatomiche dei tessuti biologici è la RMN. Come si vedrà più avanti, lo stesso fenomeno può essere utilizzato per monitorare l'attività neuronale, osservandole le variazioni emodinamiche che si associano alla elaborazione di informazioni sensoriali o ad attività cognitive del nostro cervello.

4.1.1 Formazione del segnale di risonanza magnetica nucleare
Ciascun protone possiede una carica e inoltre ha la caratteristica particolare di ruotare attorno al proprio asse, cioè possiede uno "spin". Lo spin è il moto di rotazione su se stesso; come conseguenza, visto che il protone ha una carica elettrica, questa rotazione produce un dipolo magnetico con orientamento parallelo all'asse del nucleo e caratterizzato da un momento magnetico. Si può immaginare il protone come una particella che ruota intorno al suo asse e che, ruotando, produce un campo magnetico rendendolo simile ad un piccolissimo magnete. In assenza di campo magnetico esterno, i dipoli sono disposti casualmente nello spazio. Ogni qual volta un protone è immerso in un campo magnetico, il vettore che descrive il momento magnetico si allinea parallelo o opposto al campo magnetico esterno. Più precisamente, a causa dello spin, piuttosto che semplicemente allineati, o opposti al campo magnetico, i singoli protoni hanno un movimento di precessione rispetto ad esso. La frequenza di precessione è caratteristica del nucleo atomico (ad esempio per il protone è di 43 MHz) ed è proporzionale alla forza del campo magnetico applicato. Maggiore è il campo magnetico esterno, maggiore è la frequenza di precessione.

Quando un tessuto viene posizionato all'interno di un campo magnetico, i protoni sono disposti in modo parallelo e opposto in maniera casuale. Nel giro di pochi secondi, il tessuto cerca di raggiungere un equilibrio magnetico passando da un orientamento opposto ad uno parallelo. Per raggiungere l'equilibrio magnetico, i protoni devono passare a livelli energetici minori (quelli paralleli al campo esterno) e possono farlo rilasciando energia e interagendo con gli altri atomi e molecole del tessuto. Le interazioni tra i protoni e l'ambiente fanno passare alcuni protoni dall'orientamento opposto a quello parallelo al campo. La velocità con la quale un tessuto raggiunge l'equilibrio magnetico dipende dal numero di interazioni con l'ambiente e quindi dal tipo di tessuto. La velocità con la quale i protoni si orientano rispetto al campo magnetico esterno viene definita come tempo di rilassamento T1. Una volta raggiunto l'equilibrio magnetico, vi saranno più protoni orientati parallelamente al campo magnetico, cosicché il tessuto avrà una netta magnetizzazione M0. Come detto, T1 è una proprietà dei protoni e dipende dal tipo di tessuto nel quale si trovano. Misurando quindi i valori di T1 si è in grado di capire le proprietà di un tessuto e comprendere se è prevalentemente composto da acqua, grassi, ecc..
Nella risonanza magnetica nucleare, l'allineamento degli assi di rotazione viene perturbato con un secondo campo magnetico perpendicolare al campo magnetico originale. Questo secondo campo magnetico, per poter aver effetto sui protoni e deviare i nuclei, deve oscillare alla stessa frequenza di precessione dei protoni (43 MHz). Questo secondo campo magnetico ha quindi la forma di un onda elettromagnetica e oscillerà perpendicolare al campo magnetico originale nell'ordine delle radiofrequenze (RF). Le radiofrequenze sono onde elettromagnetiche con frequenze che vanno da 100 KHz a 300 MHz. Questo secondo campo magnetico oscillatorio viene quindi fornito sotto forma di un'onda RF di durata necessaria per perturbare l'allineamento degli assi di rotazione dei protoni. L'impulso RF ha due funzioni: (1) fornisce l'energia necessaria ai protoni per allinearsi perpendicolari al campo originale e (2) riallinea le fasi di oscillazione di precessione dei singoli protoni. Quando gli impulsi RF vengono interrotti, i nuclei, interagendo con la materia circostante, tendono ad assumere il loro orientamento primitivo e nel fare ciò liberano energia sotto forma di onde radio. La frequenza delle onde radio emesse varia con la specie atomica e, per un dato nucleo atomico, con l'ambiente chimico e fisico che lo circonda. I nuclei diventano quindi dei trasmettitori di radiofrequenze, poiché risuonano a frequenze caratteristiche e rivelano la loro presenza con l'emissione di segnali. Specie nucleari diverse assorbono energia da radio onde di particolare frequenza. Questa processo viene detto risonanza magnetica nucleare.

I nuclei atomici che hanno assorbito energia dalle radio-onde applicate dall'esterno (impulso RF) liberano, quindi, l'energia assorbita mentre ritornano ad un livello energetico inferiore, emettendo così un segnale. La velocità con la quale questi nuclei ritornano ad un livello energetico inferiore viene detta tempo di rilassamento T2. T2 dipende da vari fattori fisiologici e fisici. Uno dei meccanismi principali è la presenza di variazioni locali del campo magnetico o sue inomogeneità. Queste inomogeneità del campo magnetico possono essere dovute dalla presenza di particelle o tessuti con diverse proprietà magnetiche e possono essere accentuate da fenomeni di diffusione (movimento dei protoni nei tessuti). Maggiori sono le inomogeneità del campo magnetico (reali o prodotte dal movimento dei protoni), più velocemente i protoni perderanno l'energia acquisita dal secondo campo per riallinearsi con il campo magnetico originale. Come per T1, le quote di decadimento del segnale di T2 differiscono tra i diversi tessuti corporei. Ad esempio, T2 è più lungo per i liquidi (come il cerebrospinale) e più corto per i tessuti grassi. Per la maggior parte dei segnali RMN, T2 è il meccanismo di contrasto dominante, in quanto è quello maggiormente utilizzato per ottenere immagini RMN. In aggiunta, il contenuto di ossigeno nel sangue influenza fortemente la quota di decadimento del segnale osservata, anche se di questo argomento si parlerà più approfonditamente nel prossimo capitolo, dal momento che sconfina nella visualizzazione funzionale.

4.1.2 Studio dell'attività cerebrale mediante la fMRI
Per capire il metodo fMRI, conviene partire dai principi di RMN:
(1) Un tessuto viene posizionato in un campo magnetico piuttosto forte ed omogeneo. Vari nuclei atomici, specialmente i protoni che costituiscono il nucleo dell'atomo di idrogeno, si allineano con questo campo e pervengono ad un equilibrio. In seguito a ciò il soggetto diviene "magnetizzato".
(2) I protonici hanno un movimento di precessione attraverso il campo applicato ad una frequenza caratteristica e con una orientamento favorito, e quindi prevalente, dei loro assi di rotazione.
(3) L'applicazione di un breve impulso elettromagnetico a radiofrequenze (RF) disturba l'equilibrio, e produce una situazione transiente di disturbo della magnetizzazione nucleare.
(4) Una volta terminato l'impulso RF, i protoni tendono ad assumere l'orientamento originale, rilasciando energia sotto forma di onde elettromagnetiche che possono essere percepite come segnali radio.
(5) Il segnale radio ottenuto (T2) viene registrato e sfruttato per identificare il tipo di tessuto preso in esame.

Ora si vedrà come questi fenomeni possono essere sfruttati non solo per identificare il tipo di tessuto biologico in esame, ma anche per misurare variazioni dovute a cambiamenti dell'attività neuronale. Come già detto, la quota alla quale il segnale di risonanza magnetica decade (T2) e quindi l'intensità del segnale RM, dipende da diversi fattori fisiologici e fisici. Uno dei principali meccanismi di ciò è la presenza di variazioni locali nell'intensità del campo magnetico causate dalla presenza di particelle o tessuti con differente proprietà magnetiche.

L'aumento di attività elettrica neuronale ha come conseguenza una maggior richiesta da parte dei neuroni di energia con conseguente maggior necessità di ossigeno.

Il consumo di ossigeno da parte dei neuroni è nettamente inferiore all’apporto.
La concentrazione di ossiemoglobina aumenta nelle aree corticali attive e la concentrazione relativa di deossiemoglobina diminuisce.

Durante un aumento dell'attività cerebrale, quindi, si ha un aumento localizzato del flusso sanguigno, con conseguente aumento locale della quantità di ossigeno. La molecola trasportatrice dell'ossigeno è l'emoglobina. Nello stato inattivo, le cellule nervose prelevano una certa quantità di ossigeno dall'emoglobina ossigenata (ossiemoglobina), che quindi diviene emoglobina deossigenata (deossiemoglobina). D'altro canto, il consumo di ossigeno da parte dei neuroni è inferiore all'apporto e, nelle aree attive del cervello, il flusso sanguigno porta una quantità di emoglobina ossigenata superiore a quella che viene consumata dai neuroni, per cui il rapporto tra le due forme di emoglobina è diverso da quello dello stato inattivo. Quindi, nell'area attivata vi sarà un netto aumento della concentrazione di ossiemoglobina. L'emoglobina ossigenata e l'emoglobina non ossigenata hanno proprietà magnetiche diverse e rispondono diversamente a un campo magnetico esterno. In particolare, la deossiemoglobina crea delle variazioni del campo magnetico circostante, che sono visibili come diminuzioni dei segnali RM nei valori di T2. L'effetto responsabile alle variazioni di segnali RM è detto effetto BOLD (blood oxygenation level dependent, o dipendente dal livello di ossigenazione del sangue).Il momentaneo cambiamento nel segnale RM indica un aumento della concentrazione relativa di ossiemoglobina e quindi un aumento dell'attività neuronale.

4.1.3 Proprietà dei segnali fMRI

Le variazioni del segnale fMRI sono lente (8-10 sec) rispetto alle variazioni dell'attività elettrica.

Le variazioni emodinamiche prodotte dall'attivazione corticale danno origine ad alterazioni nel segnale della risonanza magnetica funzionale. Queste alterazioni sono estremamente piccole e variano dal 2-5% in un campo magnetico di forza moderata (1,5 Tesla) a circa il 15% in un campo molto forte (4 Tesla). Tuttavia, con un adeguato rapporto segnale-rumore di fondo (SNR) nelle immagini MR, queste variazioni sono chiaramente visibili. Il segnale fMRI raggiunge un picco circa 4-6 sec in seguito alla presentazione dello stimolo. Il caratteristico ritardo della risposta è differente in base alle regioni del cervello e ai tipi di stimolazione. Così, la risoluzione temporale dell'fMRI sembra cadere a metà strada tra quella della registrazione elettrica (come l'EEG) e quella della PET. Questa latenza nella risposta probabilmente presenta dei ritardi fisiologici ripetibili. In realtà, i metodi MRI possono, in linea di principio, essere capaci di risolvere le variazioni di segnale che capitano in poche decine di millisecondi. Così, la risoluzione temporale dell'fMRI sembrerebbe essere limitata dal fenomeno (l'insorgere delle variazioni vascolari) invece che dalla strumentazione.

PRINCIPI DI FUNZIONAMENTO DELLA fMRI (UNIVERSITA' DI MODENA)

4.2 La tomografia ad emissione di positroni (PET)
La tomografia ad emissione di positroni (PET) utilizza isotopi radioattivi di elementi a basso numero atomico, che fanno parte di composti di interesse biologico, per visualizzare il metabolismo cerebrale e i processi funzionali del cervello in vivo. Incorporando isotopi (composti chimici radioattivi) che emettono positroni nelle molecole di interesse biologico, è possibile esaminare dettagliatamente numerosi processi biochimici. La tomografia ad emissione di positroni è una tecnica molto sensibile che permette di rivelare variazioni molto piccole di concentrazione dei composti chimici radioattivi. La PET usa composti radioattivi e visualizza il decadimento di queste molecole radioattive nei vari tessuti di interesse.

4.2.1 Formazione del segnale PET


La PET si basa su isotopi instabili che emettono positroni.	Detezione di coincidenze o eventi.

Gli isotopi che emettono positroni vengono preparati in un ciclotrone (un acceleratore di particelle) capace di accelerare a velocità elevatissime protoni con i quali vengono bombardati nuclei stabili di azoto, ossigeno, carbonio e fluoro. Di norma i nuclei contengono un eguale numero di protoni e di neutroni. L'incorporazione di un ulteriore protone nel nucleo ad opera di un bombardamento in un ciclotrone, produce un isotopo instabile. Perché il nucleo riacquisti la sua propria stabilità, occorre che decada e che il protone si scinda in due particelle: un neutrone che resta nel nucleo e un positrone, che è una particella elementare con massa e con carica eguale a quella dell'elettrone, ma di segno positivo. Il positrone è l'antiparticella dell'elettrone. Il positrone è una particella instabile, e non permane indefinitamente nella materia, perché urtandosi con un elettrone si annulla dando luogo ad un fotone. Questo processo si chiama annichilazione. Quindi il protone in eccesso dell'isotopo radioattivo decade in un neutrone che resta nel nucleo e un positrone che si allontana dal sito di origine dissipando energia e annichilendosi con un elettrone. L'annichilazione del positrone con un elettrone produce l'emissione di due raggi gamma che viaggiano a 180° l'uno dall'altro (i raggi gamma sono onde elettromagnetiche con energia molto alta e frequenze elevate. I due raggi gamma emessi a seguito dell'annichilazione di un positrone e di un elettrone raggiungono una coppia di rilevatori che registra un evento (l'annichilazione) esclusivamente quando vengono effettuate due rilevazioni simultanee. Il metodo della rilevazione simultanea permette un'esatta localizzazione dei siti in cui avvengono le emissioni dei raggi gamma. Il grado di risoluzione, quindi, è dell'ordine dei millimetri, poiché la sede di annichilazione del positrone che viene visualizzata con la PET può trovarsi a parecchi mm di distanza dalla sede di origine del positrone stesso. Il segnale PET è proporzionale al numero di eventi registrati e, visto che gli isotopi radioattivi decadono in modo uniforme e indipendentemente dall'ambiente in cui si trovano, esso dipende esclusivamente dalla concentrazione del tracciante (l'isotopo radioattivo).

4.2.2 Studio dell'attività cerebrale mediante la PET
Sfruttando questi principi fisici e incorporando isotopi che emettono positroni nelle molecole di interesse biologico, è possibile esaminare dettagliatamente numerosi processi biochimici. Esiste un gran numero di isotopi in grado di emettere positroni con tempi di decadimento nell'arco dei minuti e gli isotopi più comunemente utilizzati sono 15O, 11C, 13N e 18F. Essi vengono utilizzati per produrre molecole di interesse biologico in grado di emettere positroni. Il tipo di molecola viene selezionato in basi all'applicazione PET. Se si vuole ad esempio studiare le variazioni di flusso sanguigno, l'isotopo 15O viene incorporato anelle molecole di acqua, e monitorato mentre si muove nei vasi cerebrali.

Per misurare le variazioni di attività metabolica prodotta dall'attività neuronale si incorporano radioisotopi a molecole di interesse biologico come il glucosio.
L’accumulo di glucosio nelle aree cerebrale attive e’ quindi misurabile come un aumento del segnale PET.

Un'importante applicazione della scansione mediante PET è costituita dalla costruzione di mappe del metabolismo glucidico dei neuroni, un metodo che consente di mettere in evidenza l'attività delle cellule nervose. Nella maggior parte degli studi PET, viene studiato il metabolismo del glucosio, che rappresenta la principale fonte di energia per le cellule nervose. Maggiore sarà l'attività di una data cellula nervosa, maggiore sarà la quantità di glucosio assorbito dal circolo cerebrale. Un analogo del glucosio, il 2-deossiglucoso, viene assunto dai neuroni come il glucosio. Utilizzando il 18F-deossiglucoso (FDG) è possibile misurare l'utilizzazione del glucosio stesso a livello di piccole regioni cerebrali andando a misurare la concentrazione di quest'isotopo e le relative quantità di raggi gamma emessi. L'accumulo del tracciante FDG, è proporzionale alla quantità di glucosio utilizzato. Maggiore sarà la quantità di glucosio assorbito dal circolo cerebrale, maggiore sarà la quantità di fluoro radioattivo. Il segnale PET è proporzionale al numero di raggi gamma registrati e quindi una maggior concentrazione di fluoro radioattivo produrrà un segnale molto forte. E' quindi possibile ricostruire immagini dell'attività metabolica del cervello sulla base della concentrazione dei raggi gamma all'interno di un tessuto.

BASIC PRINCIPLE OF PET (UNIVERSITA' DI MELBOURNE, AUSTRALIA)


Protoni in assenza di campo magnetico esterno	Protoni allineati in modo parallelo o opposto rispetto ad un campo magnetico esterno.


La velocità con la quale si raggiunge l’equilibrio magnetico e la conseguente magnetizzazione viene detto tempo di rilassamento T1. T1 dipende dal tipo di tessuto che circonda i protoni.	La velocità con la quale i protoni ritornano all’orientamento originale viene detto tempo di rilassamento T2. T2, come T1, dipende dal tipo di tessuto che circonda i protoni.